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      IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統


      IDT(Integrated DNA Technologies)作為核酸定制合成領域的知名企業,依托30年來的技術研發,推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產品,通過對gRNA序列、Cas9核酸酶優化,對RNP轉染效率、同源重組修復HDR效率的提升,形成了從crRNA設計到CRISPR結果檢測的一站式解決方案,讓CRISPR-Cas9系統更高效、更簡單。




       

       

       

       

       

       


      Alt-R® CRISPR-Cas9概述

      IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統,分別對crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進行優化縮短、化學修飾,對化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內切酶結構域進行突變,獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能,再通過電穿孔(如Lonza Nucleofector核轉染系統)轉染RNP,可進行精確地基因編輯操作。

      傳統構建CRISPR-Cas9質粒的方法,質粒大小高達6-10kb,很難轉染,而如使用原代細胞等難轉染的細胞,轉染效率更低。且質粒不斷產生CRISPR-Cas9,使脫靶率顯著增加。IDT轉染RNP蛋白復合體的方法,通過優化CRISPR-Cas9組件,在提升剪切精確性的基礎上,提高轉染效率、減少細胞毒性、降低脫靶,進而提高了基因編輯效率。




       

       

       

       

       

       

      Alt-R® CRISPR-Cas9實驗流程

      【方法一】
      1、(使用IDT序列設計工具)設計Alt-R® crRNA,使其間隔區(Spacer)序列與DNA靶序列互補,提交給IDT定制合成crRNA;
      2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合,通過crRNA的重復序列區(Repeats)與tracrRNA堿基配對, 形成向導RNA(guide RNA,簡稱gRNA);
      3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻,形成核糖核蛋白體(ribonucleoprotein,簡稱RNP);
      4、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核;
      5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列,通過Cas9蛋白識別PAM序列(前間區序列鄰近基序,protospacer adjacent motif,簡稱PAM),對DNA進行剪切;
      6、對DNA斷裂處進行修復
      ①進行非同源末端連接修復(Non-homologous end-joining,簡稱NHEJ),實現基因敲除(knockout);
      ②(使用IDT序列設計工具)設計供體DNA模板,進行同源重組修復(Homology directed repair,簡稱HDR),實現基因敲入(knockoin)、基因敲除、基因沉默等。








       

       

       


      【方法二】
      1、(用IDT工具)設計sgRNA,使其Spacer與DNA靶序列互補,提交給IDT定制合成sgRNA;
      2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻,形成RNP;
      3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核;
      4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列,通過Cas9蛋白識別PAM序列,對DNA進行剪切;
      5、對DNA斷裂處進行修復
      ①進行非同源末端連接修復,實現基因敲除;
      ②(用IDT工具)設計供體DNA模板,進行同源重組修復,實現基因敲入、敲除、沉默等。








       

       

       

       

       

       


      Alt-R® crRNA序列設計示意圖


       

       

       

       

       

       

       

       

      Alt-R® CRISPR-Cas9產品

      1、Alt-R® crRNA:由19-20nt特異性序列(定制)和16nt通用序列融合形成,相比野生型,序列更短,中靶率更高。經化學修飾防止被細胞核糖核酸酶降解,必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。

      類型 產品名稱 規格 包裝
      crRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA 2 nmol
      10 nmol
      2 nmol
      10 nmol
      50 nmol
      100 nmol


       

       

       

      2、Alt-R® crRNA XT:相比Alt-R® crRNA,經其他化學修飾,用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗,可提高基因編輯的穩定性。必須與tracrRNA一起使用。

       

      類型 產品名稱 規格 包裝
      crRNA XT Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT 2 nmol
      10 nmol
      2 nmol
      10 nmol


       

       

       

      3、Alt-R® sgRNA:由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個RNA,含有19-20nt的特異性序列(定制)和80nt通用序列,經化學修飾,穩定性更高,用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗。相比體外轉錄的sgRNA,減少細胞免疫反應,更小細胞毒性。

       

      類型 產品名稱 規格
      sgRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA 2 nmol
      10 nmol
      50 nmol
      100 nmol
      Custom Alt-R® CRISPR sgRNA 定制


       

       

       

      4、Alt-R® tracrRNA:通用67nt序列,遠遠短于野生型的89nt,縮短后性能提高,經化學修飾,具有核酸酶抗性?商峁晒鈽擞,檢測轉染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。

       

      類型 產品名稱 特點 規格 貨號
      tracrRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA 無標記 5 nmol 1072532
      20 nmol 1072533
      100 nmol 1072534
      Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO 550 熒光標記 5 nmol 1075927
      20 nmol 1075928



      圖.穩定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞,轉染Alt-R® crRNA(未標記):tracrRNA(標記),轉染后48小時,熒光顯微鏡下10倍放大。



       

       

       

      5、Alt-R® Cas9核酸酶:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達純化,添加核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS)和C端6-His標簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶,經序列優化,提高中靶率,降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

       

      類型 產品名稱 規格 貨號
      cas9核酸酶 Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3 100 µg 1081058
      500 µg 1081059
      Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 100 µg 1081060
      500 µg 1081061

       


       

       

       

      6、Alt-R® Cas9切口酶:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達純化,添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內切酶結構域功能失活,對DNA靶向鏈進行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶,HNH結構域失活,對非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

       

      類型 產品名稱 規格 貨號
      cas9切口酶 Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3  100 µg 1081062
       500 ug 1081063
      Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3  100 µg 1081064
       500 ug 1081065


       

       

       

      7、Alt-R® dCas9蛋白:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達純化,喪失內切酶功能,添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi,進行基因下調(knockdown)等,相比RNAi,由于CRISPRi需要在轉錄起始位點附近才能發揮功能,其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白,以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

       

      類型 產品名稱 規格 貨號
      dCas9蛋白 Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3 100 µg 1081066
      500 µg 1081067


       

       

       

      8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer:是Cas9特異性的載體DNA,當使用原代細胞或難轉染細胞時,可提高Lonza(原Amaxa)Nucleofector核轉染系統等電穿孔設備對RNP的轉染效率,進而提高基因編輯效率。

       

      類型 產品名稱 規格 貨號
      電穿孔Enhancer Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer 2 nmol 1075915
      10 nmol 1075916


       

       

       


      9、Alt-R® HDR Enhancer:小分子化合物,可提高同源重組修復概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性,可用于Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶。

       

      類型 產品名稱 規格 貨號
      HDR Enhancer Alt-R® HDR Enhancer 100 µL 1081072
      500 µL 1081073


       

       

       


      10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸:專門為同源重組修復基因敲入開發,具有比標準寡核苷酸更高的穩定性和更高的摻入率,可同時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。

       

       

       

       

       

       

      Alt-R® CRISPR-Cas9優勢

      1、特別優化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度,提高基因編輯性能


      以HPRT基因中的12個位點為靶點,分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA,與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP,加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer,轉染HEK-293細胞,培養48小時后,通過二代測序檢測總的基因編輯效率,結果顯示其具有很好的穩定性。

       

       

       


      2、化學修飾RNA,增加核酸酶抗性,減少免疫應答和細胞毒性

      以HPRT1的12個位點為靶點,分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉錄(IVT)RNA,轉染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞,24小時后,測定常見應激反應基因IFIT1(A)和OAS2(B)的表達水平。(A)qPCR顯示IVT RNA強烈誘導IFIT1,而Alt-R® RNA無影響。(B)qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導可測,而Alt-R® RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應激反應相關基因均得到相似結果,說明Alt-R® RNA不會激活細胞先天免疫反應。


       

       

       

      3、優化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白,提供更高的特異性切割

       

       

       

      4、電穿孔Enhancer,提高轉染效率,尤其是原代細胞等較難轉染的細胞

      用0.125μM-4μM RNP(Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復合體),通過Lonza Nucleofector 核轉染K562細胞(A)、Jurkat細胞(B)、HEK-293細胞(C)時,使用電穿孔Enhancer(深藍色)、不使用(淺藍色)的實驗效率。



       

       

       

      5、HDR Enhancer,提高同源重組修復效率
      ①提高多種細胞HDR

      以人HPRT為靶點,使用Lonza Nucleofector核轉染系統,將4μM RNP(由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝),加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer,以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復DNA模板,轉染人多種細胞系。電轉后,細胞培養在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養基中(綠色),或培養在含有DMSO的培養基中作為陰性對照(棕色),HEK-293、HeLa培養48小時,Jurkat、K562培養72小時,通過限制性片段長度多態性(RFLP)、靶序列PCR進行HDR分析,顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復效率。


       

       

       


      ②提高多種基因HDR

      以人基因組多個位點為靶點,將4μM Alt-R® Cas9 RNP,加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板,通過電穿孔轉染。電轉后,細胞分別培養在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養基(藍色)、含有DMSO的培養基(綠色)、未處理的培養基(棕色),48-72小時后,通過RFLP、PCR進行HDR分析,顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。


       

       

       


      6、在線CRISPR序列設計工具,方便地設計高質量的crRNA/sgRNA/同源重組修復DNA模板/引物等

       

       

       

       

       

       


      如物種的基因組富含A、T,或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點不適合,IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統,盡可能滿足基因編輯需求。

      Cas9和Cas12a系統區別和應用

       

      IDT Alt-R® CRISPR Alt-R® CRISPR-Cas9系統 Alt-R® CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統
      Alt-R® Cas9核酸酶 Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶 Alt-R® Cas9 D10A切口酶 Alt-R® Cas9 H840A切口酶 Alt-R® dCas9蛋白 Alt-R® Cas12a核酸酶
      特點 通用Cas9酶,易于使用且經濟實惠 經序列優化的Cas9酶,提高中靶率,降低脫靶率,高性價比 突變的Cas9酶,在RuvC-like結構域中發生突變,使其缺失在非靶向鏈的切割能力 突變的Cas9酶,在HNH結構域中發生突變,使其缺失在靶向鏈的切割能力 突變的Cas9酶,僅結合靶向DNA,缺失核酸酶切割能力 通用Cas12a酶,富含AT的物種,或使用CRISPR-Cas9有限制
      PAM識別 NGG TTTV或TTTN
      DNA切割 雙鏈 雙鏈 靶向鏈 非靶向鏈 \ 雙鏈
      末端 平末端 5’突出 3’突出 \ 5’突出
      建議用途 一般基因編輯實驗 滿足大多數CRISPR基因編輯需求,兼顧效率和成本 適用于同時使用2種crRNA,各自識別并切割2條鏈中一條,通過將spacer由20nt提高到40nt,實現更高特異性 基因沉默,CRISPR干擾CRISPRi 無法使用Cas9的基因編輯實驗
      規格 100 μg或500 μg
      Cas9+gRNA crRNA 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),16nt通用序列 \
      tracrRNA 67nt通用序列 \
      Cas9+sgRNA sgRNA 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),80nt通用序列,經過序列修飾,不會引起細胞免疫反應,不會激活無關的基因 \
      Cas12a+crRNA crRNA \ 20-24nt特異性序列(推薦使用21nt),20nt通用序列

      注:
      N=任意堿基
      V=A、C、G
       

       


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